En la serie, al héroe le acompañan una serie de personajes secundarios, que, en ocasiones, llegan a constituirse en protagonistas absolutos de un episodio. Destacan los siguientes:
- Mary Jane Watson: Exnovia de Peter Parker Modelo y actriz.
- May Reilly Parker (Tía May): Familiar más directo con vida. Tutora de Peter Parker. Esposa de Jay Jameson.[32]
- Benjamin Parker (Tío Ben) (aparece en los recuerdos de Peter y en Amazing Fantasy #15): Marido de May, falleció a manos de un ladrón. Es uno de los personajes más importantes, ya que será el que inspire a Peter Parker en su labor superheroica. Suya es la frase que define a nuestro héroe "Un gran poder con lleva una gran responsabilidad". Hermano mayor del padre de Peter.
Conocido por ser uno de los personajes más famosos en todo el Universo Marvel que una vez muerto, jamás ha resucitado en la historia original
- J. Jonah Jameson: Alcalde de New York. Ex-propietario del Daily Bugle.
- Joseph "Robbie" Robertson: Director del renovado Daily Bugle. Un gran amigo y, en ocasiones, improvisado "psicólogo" de Peter Parker y Spider-Man.
- Norah Winters: Reportera en el Daily Bugle, novia de Randy Robertson (hijo de "Robbie") y amiga de Peter Parker. Está construyendo un reporte acerca del Duende Verde.
- Max Modell: Jefe de Peter en los Laboratorios Horizon.
- Curt Connors: Investigador experto en biología y amigo de Peter. Alter ego del Lagarto, enemigo de Spider-Man. "Murió" tras haber sido poseído de nuevo por su alter ego y haber evolucionado.
- Lily Hollister: Madre de Stanley Osborn (hijo de Harry y ella) y "alter ego" de Amenaza. Hija del ex-alcalde electo de New York.
- John Jonah "Jay" Jameson, sr.: Padre de J.J. Jameson, gran amigo de Spider-Man y esposo de May Paker.
- Liz Allen: Primera novia de Flash Thompson. Posteriormente, esposa de Harry Osborn y madre de "Normie" Osborn.
- Felicia Hardy/Gata Negra: Compañera de Spider-Man y alter ego de la Gata Negra. Ladrona y super heroína al mismo tiempo. Durante un tiempo fue novia de Flash Thompson.
- Ben Reilly/Scarlet Spider: Clon de Peter Parker creado por El Chacal, con las mismas habilidades de Spider-Man, toma el nombre de su tío y el apellido de soltera de su tía. También conocido como la Araña Escarlata. Gran amigo de Spider-Man, murió a manos del Duende Verde.
- Kaine/Tarántula: Clon de Spider-Man fallido. Mantiene un rencor hacia Ben Reilly (por ser un perfecto clon) y hacia Spider-Man. Tras sacrificar su vida por la de Peter en una batalla con los Kravinoffs, este revivió de su tumba, mutado.
- Betty Brant: Reportera del Daily Bugle. Peter salió con ella pero, posteriormente, Betty se casó con Ned Leeds, de la cual enviudó. Ned falleció mientras llevaba puesto el traje del Duende II.
- Eddie Brock/Anti-Venom: Antiguo periodista que vio su carrera hundida por una intervención de Spider-Man que reveló que había escrito un artículo falso. Cuando Peter Parker se desprendió de su traje simbionte, éste se fusionó con Eddie Brock y se convirtió en Venom. Luego de unos años sin el simbionte, las células negativas del villano Mr. Negativo se unen y re-activan las simbióticas transformando a Eddie en Anti-Venom.
Villanos:
- Duende Verde: El «otro yo» de Norman Osborn, su ambición de poder lo llevo a crear una fórmula para aumentar sus aptitudes físicas y mentales. Luego de varios enfrentamientos, Spider-Man y el Duende Verde se han convertido en sus propios némesis, llevando a Norman a descubrir la identidad secreta del héroe, embarazar y luego matar a su novia de Parker Gwen Stacy, fingir su muerte, fingir también el fallecimiento de May Parker, matar al clon de Spider-Man. Luego de ascender como el "Top Cop" de USA como Iron Patriot, Norman fue arrestado por engañar a un asgaridano para que matara cientos de personas accidentalmente y así atacar Asgard.
- El Buitre: Debido a una traición de su compañero de negocios decidió que su último invento, un arnés electromagnético que le permitía volar y aumentaba su fuerza, le sería útil para vengarse y dedicarse al crimen. En su primer enfrentamiento con Spider-Man, este no buscaba detenerlo porque eso estuviera bien, si no que lo hizo por conseguir una foto del villano para el Daily Bugle, que ofrecía una recompensa por una instantánea del Buitre. La derrota le llegó a través del ingenio de Peter Parker al inventar un aparato que invertía el campo electromagnético del arnés, haciendo que Adrian perdiera la capacidad de volar
- Puma: Thomas Fireheart es el descendiente de unos nativos americanos de Nuevo Mexico. Éstos creían en la llegada de un ser poderoso que vendría a destruir el mundo, así que comenzaban los preparativos para la llegada de este guerrero. Aunque Thomas nunca creyó en la leyenda, se esforzó para ser un guerrero poderoso, además de convertirse en un hombre mitad puma, mejorando sus reflejos y habilidad en la lucha.
- Venom III: MacDonald Gargan era un detective que J.J.Jameson contrató para que descubriera cómo Peter Parker podía conseguir las fotos de sí mismo, pero Gargan no pudo cumplir el objetivo. Por eso, Jameson le mandó a Gargan que hiciera en sí mismo unas pruebas con el científico Dr. Farley Stillwell, y así dotarlo de fuerza sobrehumana y un traje de escorpión, con el que Gargan (bajo el nombre-código Escorpión) se encargaría de acabar a Spider-Man. Tras la separación de Eddie Brock con el simbionte Venom, este se unió al Escorpión, transformándolo en un Venom más fuerte. Luego de usurparle la identidad de Spider-Man a Parker para unirse a los Vengadores que Norman Osborn formó,[44] Gargan fue arrestado junto con su jefe.
- Doctor Octopus: Otto Octavius era un científico con intenciones buenas, pero una explosión en su laboratorio generó que unos 4 brazos mecánicos que estaba usando se quedaran fundidos en él. El accidente también transtornó su mente, transformándolo en un genio malévolo. Actualmente descubrió que la radiación en el accidente le está degenerando, por lo que ahora tiene que estar en un traje especial, pero al no poder usar ninguno de sus 4 miembros naturales, Otto construyó 4 tentáculos más.
- Mysterio: Quentin Beck era un muy buen especialista en efectos especiales, pero su carencia de talento para ser una estrella, le llevó a creer que la mejor forma de hacerse famoso era derrotando un héroe. En esos momentos, Spider-Man recién había surgido, por lo que fue la elección de Beck. Mysterio demostró ser buen contrincante es sus primeras batallas. Pero empezó a perder su credibilidad al ser vencido constantemente, además se le diagnosticaron cáncer pulmonar y cerebral (debido a la radiación y químicos con los que trabajaba). Al ver que no tenía ninguna razón para seguir vivo, Beck se suicidó. Pero, años luego apareció para tomar su manto de Mysterio (tomado por Francis Klum), misteriosamente Beck está vivo.
- Lagarto: Tras perder su brazo en la guerra, el cirujano Curt Connors, se especializó en la habilidad de los Lagartos para regenerar miembros perdidos. Connors preparó un suero que le dotaría su brazo perdido, pero en vez de eso, Curt se convirtió en un lagarto gigante. Tras ser ayudado por Spider-Man, Curt volvió a la normalidad, pero cuando está bajo mucho estrés, Curt vuelve a su forma animal. Actualmente, El Lagarto se apoderó de nuevo de Connors, matando su contraparte mamífera y mudando de piel. Ahora El Lagarto tiene un cerebro más desarollado (es capaz de hablar y razonar) y puede liberar lo que el llama "el cerebro reptil" de la gente a la que esta cerca.
- Electro: El electricista Max Dillon estaba reparando unos cables cuando un rayo lo alcanzó, pero en vez de morir, su bioquímica cambió, transformándolo en una "batería humana". Fue despedido de su trabajo, y pensó que podría conseguir una indemnización robando. Con el paso del tiempo sus poderes fueron saliéndose de contról, con la ayuda de Mad Thinker, Electro logró controlar y aumentar exponencialmente sus poderes.
- Rhino: Aleksei Sytsevich era un inmigrante ruso que se dirigió a los Estados Unidos. Para poder conseguirle dinero a su familia, Aleksei aceptó un contrato con unos agentes, que le implantaron una armadura similar a la de un rinoceronte. Rhino se transformó en un criminal profesional, pero siempre era vencido por el ingenio de Spider-Man. Luego de un meses de dejar su carrera criminal (viviendo una vida con trabajo y pareja), Aleksei volvió al manto de Rhino para matar a Rhino II.[53]
- Camaleón: El Camaleón nació en Rusia y su nombre era Dmitri Smerdyakov. En su juventud fue el sirviente y hermanastro de Kraven, el cazador. Finalmente Dmitri emigró a los Estados Unidos, adoptando la identidad del criminal Camaleón. Durante esta primera etapa criminal, se hizo pasar por Spider-Man para efectuar un atrevido robo de planes militares secretos americanos. Estuvo a punto de conseguirlo, pero fue detenido por el Spider-Man original. Actualmente esta aliado con la viuda de Kraven.
- Carnage: Cletus Kasady era el compañero de celda de Eddie Brock, cuando el simbionte rescató al segundo, este dejó un rastro atrás el cual se fortaleció y se unió a Kasady. Una noche, Kasady escapó de su prisión tras asesinar a un guardia, comenzando una serie de asesinatos espantosos y aparentemente al azar. En la escena de cada crimen, él escribía "Carnage manda" ("Carnage Rules") en las paredes con su propia sangre. Spider-Man lo encontró, aunque el héroe no fue rival para el poder de Carnage. Desesperado, Spider-Man hace, a su pesar, la primera de las muchas treguas con Venom para luchar contra Carnage. En una fuga de La Balsa fue muerto por El Vigía.
- Kingpin: Wilson Fisk era un cerebro del crimen, inmiscuido en numerosas actividades ilegales tales como tráfico de estupefacientes, contrabando, asesinatos, entre otras. Pese a esto no tenía antecedentes criminales, poseía un ejército de abogados, una estrategia financiera y criminal sin paralelo. Fisk no tiene poderes sobrehumanos, pero su cuerpo de más de 200 kg es principalmente músculo sólido. Es un luchador excepcional que se ha enfrentado con Spider-Man; no obstante, Daredevil ocupa su principal atención. Conoce la identidad de Daredevil desde hace años, debido a la indiscreción de Karen Page. Ha utilizado a un gran número de criminales y asesinos, entre los que destacan Bullseye y Typhoid Mary.
- Kraven: Sergei Kravinoff era conocido como el mejor cazador del mundo, hasta que su obsesión por cazar a Spider-Man lo llevó a convertirse en un villano. Tras haberlo intentado con otros rivales, se planteó una última cacería para matar a Spider-Man, pero falló y se suicidó. Recientemente fue resucitado por Sasha Kravinoff, sus hijos, Mysterio y Electro, usando la sangre del clon de Spider-Man, Kaine. Tras un intento fallido de que Spider-Man lo matara, se retiró a la Tierra Salvaje junto a su hija, Ana y Alyosha Kravinoff, tras matar a Sasha.
- Alistair Smythe: Uno de los principales enemigos de Spider-Man. En la serie de spiderman de 1994, trabaja para Kingpin, en un principio Smythe utilizaba una silla de ruedas, primero convencional y más tarde con tracción electrogravitatoria y equipada con una computadora, pero más tarde ganó la capacidad de caminar tras transformarse en lo que él llamó el Ultimate Spider-Slayer. Debido a una confusión y a un engaño por parte de Kingpin creyó que spiderman había matado a su padre, Spencer Smythe, por eso creó artilugios robóticos para intentar matar a spiderman por venganza.
